Mapa de proteínas espacialmente resolvidas de vírions de citomegalovírus humano intactos

Nature Microbiology volume 8, páginas 1732–1747 (2023)Cite este artigo

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Os herpesvírus montam grandes partículas envelopadas que são difíceis de caracterizar estruturalmente devido ao seu tamanho, fragilidade e proteoma complexo de múltiplas camadas com natureza parcialmente amorfa. Aqui usamos espectrometria de massa de reticulação e proteômica quantitativa para derivar um mapa interativo espacialmente resolvido de vírions de citomegalovírus humano intactos. Isto permitiu a atribuição de novo de 32 proteínas virais em quatro camadas de viriões espacialmente resolvidas, cada uma organizada por uma proteína de estrutura viral dominante. A proteína viral UL32 envolve todas as camadas em uma orientação radial N-para-C-terminal, ligando o nucleocapsídeo ao envelope viral. Observamos a incorporação específica da camada de 82 proteínas hospedeiras, das quais 39 são recrutadas seletivamente. Descobrimos como o UL32, pelo recrutamento da fosfatase PP-1, antagoniza a ligação às proteínas 14-3-3. Este mecanismo garante uma biogênese viral eficaz, sugerindo um papel perturbador da interação UL32-14-3-3. Finalmente, integramos esses dados em um modelo de granulação grossa para fornecer insights globais sobre a configuração nativa das interações do vírus e da proteína hospedeira dentro dos herpesvirions.

A montagem estruturada de partículas infecciosas, chamadas vírions, é fundamental para a transmissão do vírus entre células e organismos. Os vírions contêm o genoma do ácido nucleico viral encerrado em um invólucro proteico do capsídeo. Várias proteínas co-embaladas facilitam o processo de infecção e o início da expressão gênica viral. Os herpesvírus, uma família de vírus de DNA de fita dupla, reúnem partículas particularmente grandes e complexas, acomodando muitas proteínas diferentes que são entregues à célula hospedeira após a infecção.

A capacidade dos herpesvirions de incorporar um grande conjunto de proteínas é possibilitada pela sua típica arquitetura multicamadas1. O envelope lipídico externo abriga várias glicoproteínas virais necessárias para a ligação ao receptor da célula hospedeira e fusão da membrana2. O espaço entre o envelope e o nucleocapsídeo icosaédrico central é preenchido por uma matriz proteica, o tegumento. Embora as proteínas individuais do tegumento tenham sido alocadas em subcamadas internas e externas distintas com base em dados bioquímicos e microscópicos , os detalhes da organização das proteínas do tegumento não são compreendidos. As partículas do herpesvírus também incorporam numerosas proteínas hospedeiras, mas muito poucos destes eventos foram caracterizados funcional ou mecanicamente6,7.

Estudos recentes de microscopia eletrônica criogênica (cryoEM) de herpesvirions revelaram subestruturas do nucleocapsídeo8,9, do portal10,11 e de vários complexos de glicoproteínas2,12,13. Além disso, estudos anteriores forneceram apenas informações sobre a composição proteica global dos herpesvirions, identificando entre 46 e 82 proteínas virais14,15,16,17,18. No entanto, falta uma caracterização sistemática da coordenação espacial e das interações do vírus e das proteínas do hospedeiro dentro dos vírions.

Aqui usamos espectrometria de massa de reticulação (XL-MS) para construir um mapa de proximidade de 32 proteínas virais e 82 hospedeiras em vírions extracelulares intactos do citomegalovírus humano (HCMV), o maior herpesvírus humano. Os dados permitem a alocação de novo de proteínas hospedeiras e virais e suas interações proteína-proteína (PPIs) às camadas de virions, fornecendo insights sobre a organização das subcamadas do tegumento. Descobrimos que a proteína viral UL32 (também conhecida como pp150) atua como uma estrutura dominante, envolve-se em PPIs através da partícula e medeia o recrutamento de proteínas hospedeiras, como proteínas 14-3-3 e proteína fosfatase 1 (PP-1) . PP-1 antagoniza a ligação de 14-3-3 a UL32 e é necessária para o início eficiente da expressão gênica viral e produção de progênie viral. Assim, ao mapear a organização do proteoma dentro dos herpesvirions nativos, fornecemos uma base para a compreensão estrutural e funcional de IBPs cruciais.

0.75 in n = 2 biological replicates) in virions (bottom bar). d,e, Purified virions from recombinant mutant viruses harbouring alanine substitutions in the designated motifs were assessed for protein levels by immunoblotting. Representative experiments of n = 2 biological replicates are shown./p>91% of the protein copies inside a virus particle./p>

10 copies) be identified in both replicates. When a crosslink involved a lower-abundance protein (that is, <10 copies), we required that the crosslink be identified in only one of the replicates. The rationale is that this balances crosslink confidence for highly abundant proteins with sensitivity for low-abundance proteins. Second, PPIs were only reported when there were two unique crosslinks identified, giving a higher-confidence set of PPIs. To retain only host proteins incorporated into the particle, host proteins that did not directly link to viral proteins were removed. The filtered set of crosslinks is available in Supplementary Table 2. The list of the corresponding PPIs together with evidence from existing data is available in Supplementary Table 3. The XL-based PPI network was generated on the basis of interprotein crosslinks from Supplementary Table 2 and visualized using edge-weighted spring-embedded layout70 in Cytoscape v.3.7.2. Edge weighting was based on the number of identified interlinks between protein pairs. Additional crosslink networks between selected proteins were visualized using xiNET71./p>

0.75 were considered (from the Phospho (STY).txt table). The positions of individual phosphosites as identified from this experiment were used to map phosphosites on the UL32 amino acid sequence (Fig. 4c). Phosphosite SILAC ratios were also corrected for the protein-level SILAC ratios (from proteinGroups.txt) as quantified from an analysis of the whole-virion proteome without IMAC enrichment. Phosphosites were excluded when the corresponding phosphopeptide contained residues mutated in the SILK/RVxF motifs of UL32. Then, protein-level corrected phosphosite ratios were averaged (quantification in both replicates required)./p>0.6 were considered./p>

220 nm). These correspond to the median of diameters from the purified sample ± two times the standard deviation. The fraction of particles with diameters that fall below 160 nm, exceed 220 nm or fall in between are indicated for the non-cross-linked (d) or cross-linked (e) sample types. Purification results in more homogeneous particle diameters, enriching virions in the expected size range. Thus, our protocol captures the native configuration of the particles at relatively high sample purity. At least 367 particles were counted per condition./p>