Observação direta dos estados conformacionais do PIEZO1

Nature volume 620, páginas 1117–1125 (2023)Cite este artigo

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PIEZOs são canais iônicos mecanossensíveis que convertem força em sinais quimioelétricos1,2 e desempenham papéis essenciais em diversos ambientes fisiológicos3. Estudos in vitro propuseram que os canais PIEZO transduzem a força mecânica através da deformação de extensas lâminas de domínios transmembrana que emanam de um poro central condutor de íons . No entanto, pouco se sabe sobre como estes canais interagem com o seu ambiente nativo e quais os movimentos moleculares subjacentes à activação. Aqui observamos diretamente a dinâmica conformacional das lâminas de moléculas PIEZO1 individuais em uma célula usando imagens de fluorescência nanoscópicas. Comparado com modelos estruturais anteriores do PIEZO1, mostramos que as lâminas são significativamente expandidas em repouso pela tensão de flexão exercida pela membrana plasmática. O grau de expansão varia dramaticamente ao longo do comprimento da lâmina, onde a diminuição da força de ligação entre os subdomínios pode explicar o aumento da flexibilidade da lâmina distal. Utilizando moduladores químicos e mecânicos do PIEZO1, mostramos que a expansão da lâmina e a ativação do canal estão correlacionadas. Nossas descobertas começam a descobrir como o PIEZO1 é ativado em um ambiente nativo. De forma mais geral, à medida que detectamos com segurança mudanças conformacionais de nanômetros únicos de populações de canais, esperamos que esta abordagem sirva como uma estrutura para a análise estrutural de proteínas de membrana através de imagens nanoscópicas.

A capacidade de sentir e transduzir informações mecânicas do ambiente é crítica para uma ampla variedade de processos fisiológicos em todos os domínios da vida9. Os canais de mecanotransdução aproveitam o trabalho mecânico para abrir diretamente um poro condutor de íons em resposta a perturbações na membrana celular, iniciando a sinalização celular . Os PIEZOs são uma família de canais de mecanotransdução encontrados em Eukarya1,2 e medeiam uma vasta gama de processos fisiológicos em mamíferos, incluindo sensação de toque11, controle da pressão arterial12, desenvolvimento vascular13,14, coceira mecânica15 e estado de hidratação eritrocitária16.

PIEZOs são grandes proteínas de membrana homotriméricas estruturalmente dispostas como um tríscele 4,5,7 (Fig. 1a). Cada protômero entra em contato com o poro central e os domínios de tampa próximos ao terminal C e projeta uma lâmina de 36 domínios transmembrana que se estende tanto para fora quanto para cima em direção ao terminal N. Embora apenas estejam disponíveis estruturas de microscopia crioeletrônica parcial (crio-EM) de PIEZO1 sem aproximadamente um terço das lâminas distais, o homólogo estrutural PIEZO2 foi resolvido com o complemento total de domínios transmembrana . Em modelos estruturais e previsões, as lâminas formam um formato de tigela com aproximadamente 24 nm de diâmetro e 9 nm de profundidade, com uma área total projetada de aproximadamente 450 nm2. As lâminas conectam-se diretamente ao poro através de um feixe intracelular, sugerindo que ambas são alavancas que controlam diretamente o canal e os sensores primários de força mecânica6.

a, Modelos estruturais de PIEZO1, vistos extracelularmente. A estrutura crio-EM mais completa do PIEZO1 com a falta distal de aproximadamente um terço da lâmina destacada (esquerda) e a previsão da estrutura AlphaFold II do PIEZO1 (direita) são mostradas. O domínio extracelular C-terminal (CED) é removido do modelo AlphaFold II devido à má previsão. As tags TCO*K na posição 103 são mostradas como estrelas magenta. Cada protômero é colorido separadamente. b, Segmentação de partículas candidatas a PIEZO1 a partir de localizações iPALM. Uma imagem representativa de contraste de interferência diferencial × 100 (de n = 5 células) de uma célula HEK293 expressando TCO * K 103 PIEZO1 marcada com tetrazina – Alexa Fluor 647 (AF647) (canto superior esquerdo; barra de escala, 10 µm). Uma renderização de 3 nm por pixel das localizações da membrana plasmática a partir da inserção magenta no canto superior esquerdo (barra de escala, 3 μm) (parte superior central). Localizações binárias AF647 (pontos magenta) com moléculas candidatas PIEZO1 atendendo aos requisitos do vizinho mais próximo destacadas com caixas ciano (barra de escala, 3 µm) (canto superior direito). Também são mostradas representações representativas de 3 nm por pixel de moléculas PIEZO1 com marcação tripla candidatas que atendem aos requisitos mínimos de separação de interlocalização (barras de escala, 30 nm) (parte inferior). c, Superpartícula fundida de localizações triméricas PIEZO1 identificadas com promoção de simetria tripla, visualizadas de cima para baixo (n = 5 células fotografadas, n = 726 moléculas e n = 8.500 localizações). As localizações foram visualizadas com tamanho e cor proporcionais à densidade local (ver Métodos). d, Superpartícula com limite para uma densidade local superior a 0,5 × 10−5, o mínimo que abrange localizações dentro de uma esfera de 60 nm (esquerda). Localizações associadas a cada lâmina isolada com k-means agrupamento com k = 3 clusters (direita). e, Gráfico de dispersão das distâncias médias entre lâminas por localização entre cada localização dentro de um aglomerado de lâminas da superpartícula na parte c e todas as localizações em um aglomerado de lâminas vizinho, colorido pela densidade local. Na posição 103, a distância entre lâminas mais provável é 25,4 ± 5,9 nm (média ± dp), em comparação com 19,2 nm calculados a partir do modelo AlphaFold II.